A.  Latar Belakang

Reaksi berantai polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro. Metode ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis, seorang peneliti di perusahaan CETUS Corporation. Pada awal perkembangannya metode PCR hanya digunakan untuk melipatgandakan molekul DNA, namun kemudian dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul mRNA. Saat ini metode PCR telah banyak digunakan untuk berbagai macam manipulasi dan analisis genetik.

Metode PCR tersebut sangat sensitif, sehingga dapat digunakan untuk melipatgandakan satu molekul DNA. Metode ini juga sering digunakan untuk memisahkan gen-gen berkopi tunggal dari sekelompok sekuen genom. Dengan menggunakan metode PCR, dapat diperoleh pelipatgandaan suatu fragmen DNA (110 bp, 5×109 mol) sebesar 200.000 kali setelah dilakukan 20 siklus reaksi selama 220 menit (Mullis dan Fallona, 1989). Hal ini menunjukkan bahwa pelipatgandaan suatu fragmen DNA dapat dilakukan secara cepat. Kelebihan lain metode PCR adalah bahwa reaksi ini dapat dilakukan menggunakan komponen dalam jumlah sangat sedikit, misalnya DNA cetakan (template) yang diperlukan hanya sekitar 5 µg, oligonukleotida yang diperlukan hanya sekitar 1 mM dan reaksi ini bisa dilakukan dalam volume 50 – 100 πl.

Konsep asli teknologi PCR mensyaratkan bahwa bagian tertentu sekuen DNA yang akan dilipatgandakan harus diketahui terlebih dahulu sebelum proses pelipatgandaan tersebut dapat dilakukan. Sekuen yang diketahui tersebut penting untuk menyediakan primer, yaitu sekuen oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA dalam reaksi berantai polimerase. Pengembangan lebih lanjut metode PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu fragmen DNA yang belum diketahui sekuennya, misalnya dengan metode Alu-PCR (Rosenthal, 1992). Alu adalah suatu sekuen DNA (panjangnya kurang lebih 300 bp) yang banyak terdapat sepanjang genom manusia (repetitive DNA sequence). Alu-PCR adalah metode PCR yang memanfaatkan sekuen-sekuen Alu sebagai dasar untuk membuat primer untuk melipatgandakan suatu fragmen DNA yang belum diketahui sekuen yang terdepat di antara dua sekuen Alu.

B. Polymerase Chain Reaction

Pelaksanaan metode PCR memerlukan empat komponen utama, yakni DNA cetakan, oligonukleotida primer, deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan) enzim polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA. Proses PCR terdiri dari tiga tahap, yakni denaturasi, penempelan (annealing), dan amplifikasi. Pada tahap denaturasi, suatu fragmen DNA (duoble strand) dipanaskan pada suhu 95 0C selama 1-2 menit sehingga akan terpisah menjadi rantai tunggal (singlestrand). Kemudian dilakukan penempelan (annealing) pada suhu 55 0C selama1-2 menit, yakni oligonukleotida primer menempel pada DNA cetakan yang komplementer dengan sekuen primer. Setelah dilakukan penempelan, suhu dinaikkan menjadi 72 0C selama 1,5 menit. Pada suhu ini, enzim DNA polimerase akan melakukan poses polimerasi, yakni rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan. Proses ini disebut amplifikasi (Triwibowo, 2006).

C. Penggolongan Teknik PCR

Berdasarkan pasangan primer yang digunakan dalam teknik PCR, maka ada dua macam teknik PCR yaitu (1) metode yang menggunakan sepasang primer (primer yang ditempatkan di awal dan di akhir unit transkripsi) dimana primer-primer tersebut sangat spesifik urutannya untuk menyambungkan dirinya dengan segmen DNA; dan (2) metode yang menggunakan primer tunggal (primer yang ditempatkan di awal unit transkripsi atau di akhir unit transkripsi) (Triwibowo, 2006).

Metode PCR dengan primer tunggal, meliputi : AP-PCR (Arbitrary Primed PCR), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), serta DAF (DNA Amplification Fingerprinting) yang meliputi proses amplifikasi dari DNA/VNTRs dan Retroposon. Persamaan dari ketiga teknik ini adalah adanya urutan acak dari primer, baik yang bekerja ke arah kanan maupun ke arah kiri dari sejumlah lokus. Perbedaan dari ketiga teknik tersebut terdapat pada panjang-pendeknya primer, dimana untuk AP-PCR sekitar 20 basa nukleotida, RAPD sekitar 10 basa nukleotida dan DAF sekitar 6-8 nukleotida. Hasil visualisasi dari AP-PCR dan RAPD relatif sama, sehingga orang lebih menyukai RAPD karena dengan ukuran primer yang lebih sedikit (~10 basa nukleotida) memberikan hasil yang tidak berbeda dengan AP-PCR yang memiliki ukuran primer lebih besar (~20 basa nukleotida).

Metode PCR dengan menggunakan sepasang primer, meliputi : STSs (Sequence-Tagged Sites) dan SCARs (Sequence Characterized Amplified Regions), DALP (Direct Amplification of Length Polymorphism), SSRs (Simple Sequence Repeats), IFLP (Intron Fragment Length Polymorphism), ESTs (Expressed Sequence Tags), RAMP (Random Amplified Microsatellite Polymorphism) dan REMAP (Retroposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) dan modifikasinya, SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism).

D. Pengembangan Teknik PCR

Sejak pertama kali diperkenalkan, teknik PCR telah berkembang sangat pesat dan diaplikasikan untuk bemacam-macam tujuan, baik untuk riset dasar maupun aplikasi praktis. Pada aspek metodologinya, teknik PCR yang pertama kali diperkenalkan memerlukan banyak kondisi khusus untuk menjamin keberhasilannya. Sebagai contoh, pada awalnya teknik PCR hanya digunakan untuk mengamplifikasi molekul DNA dengan menggunakan DNA sebagai bahan awal (starting material) yang akan digunakan sebagai cetakan. Dalam hal ini molekul DNA yang aakan diamplifikasi harus diisolasi terlebih dahulu dari sel atau jaringan. Perkembangan lebih lanjut teknik ini memungkinkan para peneliti menggunakan molekul RNA sebagai bahan awal, yaitu dengan berkembangnya teknik Reverse Trancriptase PCR (RT-PCR). Selain itu, sekarang juga dikembangkan teknik PCR yang tidak memerlukan langkah isolasi molekul DNA terlebih dahulu sebelum diamplifikasi. Dalam hal ini PCR dapat dilakukan dengan menggunakan sel atau jaringan sebagai bahan awal tampa harus melakukan isolasi DAN secara khusus. Dengan teknik ini, PCR dapat dilakukan di dalam sel atau jaringan tersebut sehingga teknik ini dikenal sebagai PCR In Situ. Selain itu, teknik PCR sekarang juga dapat dilakukan secara efisien untuk amplifikasi molekul DNA yang panjang. Secara ringkas kedua macam teknik ini dijelaskan sebagai berikut.

1. Reverse Trancriptase PCR (RT-PCR)

Teknik ini dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam sel. Sebelum teknik ini dikembangkan, analisis terhadap molekul mRNA biasanya dilakukan  dengan metode hibridisasi In Situ, northern blot, dot blot, atau slot blot, analisis menggunakan S1 nuklease, atau dengan metode pengujian proteksi RNAse (RNAse protection assay). Teknik RT-PCR dikembangkan untuk mengatasi kelemahan-kelemahan metode PCR yang lain.

RNA tidak dapat digunakan sebagai cetakan pada teknik PCR, oleh karena itu perlu dilakukan proses transkripsi balik (reverse transcription) terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh molekul cDNA (complementary DNA). Molekul cDNA tersebut kemudian digunakan sebagai cetakan dalam proses PCR. Teknik RT-PCR ini sangat berguna untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk amplifikasi RNA sebelum dilakukan cloning dan analisis, maupun untuk diagnosis agensia infektif maupun penyakit genetik.

Teknik RT-PCR memerlukan enzim transcriptase balik (DNA polymerase) yang bisa menggunakan molekul DNA (cDNA) sebagai cetakan untuk menyintesis molekul cDNA yang komplementer dengan molekul RNA tersebut. Beberapa enzim yang bisa digunakan antara lain mesophilic viral reverse transcriptase (RTase) yang dikode oleh virus avian myoblastosis (AMV) maupun oleh virus moloney murine leukemia (M-MuLV), dan Tth DNA polymerase. RTase yang dikode oleh AMV maupun M-MuLV bersifat sangat prosesif dan mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 10 kb, sedangkan Tth DNA polymerase mampu menyintesis cDNA sampai sepanjang 1-2 kb.

Berbeda dengan Tth DNA polymerase, enzim RTase AMV dan M-MuLV mempunyai aktivitas RNAse H yang akan meyebabkan terjadinya degradasi RNA dalam hybrid RNA-cDNA. Aktivitas semacam ini dapat merugikan jika berkompetisi dengan proses sintesis DNA selama proses produksi untai pertama cDNA. Enzim RTase yang berasal dari M-MuLV mempunyai akyivitas RNase H yang lebih rendah dibanding dengan yang berasal dari AMV.

Enzim M-MuLV mencapai aktivitas maksimum pada suhu 37o C, sedangkan enzim AMV pada suhu 42o C dan Tth DAN polymerase mencapai aktivitas maksimum pada suhu 60-70o C. Penggunaan enzim M-M-MuLV kurang menguntungkan jika RNA yang digunakan sebagai cetakan mempunyai struktur sekunder yang ekstensif. Di lain pihak, penggunaan Tth DNA polymerase kurang menguntungkan jika ditinjau dari kebutuhan enzim ini terhadap ion Mn karena ion Mn dapat mempengaruhi ketepatan (fidelity) sintesis DNA. Meskipun demikian, enzim Tth DNA polymerase mempunyai keunggulan karena dapat digunakan untuk reaksi transkripsi balik sekaligus proses PCR dalam satu langkah reaksi.

Reaksi transkripsi balik dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa macam primer yaitu :

  1. Oligo(dT) sepanjang 12-18 nukleotida yang akna melekat pada ekor poli (A)pada ujung 3’ mRNA mamalia. Primer semacam ini pada umumnya akan menghasilkan cDNA yang lengkap.
  2. Heksanukleotida acak yang akan melekat pada cetakan mRNA yang komplementer pada bagian manapun. Primer semacam ini akan menghasilkan cDNA yang tidak lengkap (parsial).
  3. Urutan nukleotida spesifik yang dapat digunakan secara selektif untuk menyalin mRNA tertentu.

 2. PCR In Situ

Analisis DNA atau lumRNA hasil transkripsi dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, misalnya hibridisasi DNA : RNA atau DNA : DNA, dengan sistem dot blot atau slot blot. Analisis dapat dilakukan dengan terlebih dahulu melakukan isolasi DNA atau mRNA dari sel atau jaringan, atau dengan metode yang lebih maju yaitu dengan analisis langsung sel pada jaringan yang bersangkutan tanpa harus melakukan isolasi DNA atau mRNA terlebih dahulu. Teknik semacam ini dikenal sebagai In Situ Hybridisation (hibridisasi In Situ). Teknik ini memerlukan molekul RNA atau DNA target dalam jumalh paling tidak 20 kopi dalam satu sel agar dapat terdeteksi. Oleh karena itu, teknik hibridisasi hibridisasi In Situ paling sering digunakan untuk analisis mRNA karena jumlahnya per sel pada umumnya lebih banyak dibandingkan dengan DNA. Jumlah genom virus laten yang menginfeksi suatu sel misalnya, seringkali hanya terdiri atas beberapa kopi. Demikian pula mutasi gen, translokasi kromosom dan perubahan patologis awal seringkali hanya melibatkan beberapa kopi sekuen nukleotida sehingga akan sukar dideteksi dengan teknik hibridisasi In Situ. Oleh karena itu, untuk analisis molekul DNA yang jumlah kopinya sangat sedikit di dalam sel, harus dilakukan amplifikasi terlebih dahulu secara In Situ. Teknik yang mengombinasikan amplifikasi PCR dengan hibridisasi In Situ dikenal sebagai teknik PCR In Situ (Komminoth dan Long, 1995)

Sebelum dilakukan PCR In Situ, sel atau sampel jaringan harus difiksasi dan dipermeabilisasi terlebih dahulu. Fiksasi dilakukan untuk mempertahankan DNA atau RNA dan morfologi sel atau jairngan. Biasanya yang digunakn untuk fiksasi ada;ah formalin dan paraformaldehid. Jaringan yang masih segar atau sel dengan membrane yang masih utuh merupakan sampel yang ideal. Meskipun demikian, sampel jaringan yang sudah difiksasi dengan formalin juga dapat digunakan untuk PCR In Situ. Sel yang masih utuh akan mengalami kerusakan nukleotida yang jauh lebih sedikit dan membrane sel yang ada akan menjadi pelindung terhadap produk amplifikasi .

Permeabilisasi dapat dilakukan dengan menggunakan enzim, misalnya proteinase K, tripsin atau pepsinogen, sehingga primer, enzim DNA polymerase dan nukleotida dapat masuk ke dalam inti sel (nucleus). Setelah permeabilisasi, enzim protease yang digunakan harus dinonaktifkan sebab sisa-sisa enzim ini dapat menghasncurkan DNA polymerase yang digunakan dalam PCR.

Setelah dilakukan fiksasi dan permeabilisasi, kemudian dilakukan amplifikasi In Situ yaitu dengan menambahkan komponen-komponen yang diperlukan untuk PCR. Setelah dilakukan PCR, selanjutnya sel atau jaringan yang digunakan diambil lagi dan dilekatkan pada gelas obyek (object glass). Sebagian lisat sel dianalisis dengan elektroforesis gel. Produk PCR hasil amplifikasi In Situ yang ada di dalam sel kemudian dianalisis dengan metode hibridisasi In Situ atau dengan imunohistokimia. Secara umum teknik PCR In Situ dapat dibedakan menjadi dua, yaitu (1) PCR In Situ tidak langsung (Indirect In Situ PCR), dan (2) PCR In Situ langsung (Direct In Situ PCR). Pada teknik PCR In Situ tidak langsung, dilakukan amplifikasi In Situ dna hibridisasi In Situ, tetapi pelacak (probe) disiapkan tersendiri. Sebaliknya, pada teknik PCR In Situ langsung, dilakukan amplifikasi In Situ dengan menggunakan pelacak secara khusus. Teknik PCR In Situ langsung dianggap merupakan teknik yang lebih cepat dibandingkan dengan teknik PCR In Situ tidak langsung untuk deteksi DNA atau RNA tanpa harus melakukan hibridisasi In Situ. Meskipun demikian, teknik PCR In Situ langsung memberikan hasil yang kurang meyakinkan, disbandingkan dengan teknik PCR In Situ tidak langsung, jika digunakan untuk sampel berupa potongan jaringan.

Dalam penerapan teknik PCR In Situ ini ada beberapa variabel penting yang harus diperhatikan, antara lain (1) tipe bahan awal yang digunakan (sel, potongan jaringan, atau yang lain), (2) tipe dan jumlah kopi urutan nukleotida yang menjadi target (DNA genom, DNA virus, atau RNA), (3) metode amplifikasi cDNA yang digunakan (menggunakan primer tunggal atau lebih dari satu promer), (4) sistem deteksi (langsung atau tidak langsung), (5) penggunaan kontrol dalam eksperimen.

Tekni PCR in situ telah berkembang (Gu, 1995) sehingga sekarang terdapat empat variasi, yaitu (1) PCR in situ langsung, (2) PCR in situ tidak langsung. (3) RT-PCR in situ, dan (4) 3SR (self-sustainded sequence replication reaction). RT-PCR in situ adalah PCR in situ dengan menambahkan reaksi transkripsi balik (reverse transcription), sedangkan teknik 3SR adalah teknik amplifikasi mRNA in vitro dengan menggunakan tiga macam enzim, yaitu transkriptase balik AMV, T7 RNA polimerase, dan Rnase H yang berasal dari Escherichia coli. Dengan metode ini dapat dilakukan proses transkripsi balik dan reaksi transkripsi untuk menggandakan RNA melalui hibrid RNA/DNA dan cDNA. Metode ini dikembangkan oleh Ingenborg Zehbe dan kawan-kawan sebagai alternatif terhadap metode RT-PCR untuk deteksi RNA dengan jumlah kopi yang sangat kecil. Metode ini pada dasarnya tidak seperti metode PCR karena semua reaksi dilakukan pada suhu 42˚C dan tidak memerlukan alat thermocycler.

 

Referensi:

Gu, J. 1995. In Situ PCR-An Overview. In: Jiang Gu (Ed.). In Situ PCR and Related Technology. Birkhauser Boston.

Komminoth, P., Long, A.A. (1995) In situ polymerase chain reaction and its applications to the study of endocrine diseases. Endocr Pathol 6:167–171.

Maullis, K.B., and Fallona, F.A. 1989. Spesific syntesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. In: Wu, R., Grossman, L., and Moldlave, K. (Eds.). Recombinant DNA Methodology. Academic Press, Inc., San DIego.

Rosenthal, A. 1992. PCR Amplification techniques for chromosome walking. TIBTECH 10:44-48.

Yuwono, T. 2006. Teori Dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Yogyakarta: Andi offset.

Leave a Reply